ELISA質(zhì)量控制
ELISA 是一種敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法，由于其試劑穩(wěn)定、易保存、操作簡便、結(jié)果判斷較客觀等因素，以及既適宜于大規(guī)模篩查試驗(yàn)又可以用于少量標(biāo)本的檢測，既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和細(xì)胞因子等領(lǐng)域。ELISA 的影響因素較多，加強(qiáng)質(zhì)量管理才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。

一、質(zhì)量控制血清

質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗(yàn)中加入一份或數(shù)份，通過所得結(jié)果來了解本次檢驗(yàn)的情況。質(zhì)控血清檢驗(yàn)的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi)，就說明該檢驗(yàn)沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗(yàn)不合格，應(yīng)尋找原因，糾正后，重檢待測標(biāo)本。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。

1.質(zhì)控血清的使用

衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心制備的乙肝標(biāo)志物質(zhì)控血清，可以在-20℃保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時(shí)，應(yīng)先混勻，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反復(fù)冰融或自行分裝。開展某項(xiàng)檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清，一般按3-6個月用量準(zhǔn)備。自制的不定值質(zhì)控血清，在一批質(zhì)控血清將用完之前，需準(zhǔn)備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定，較長期內(nèi)效價(jià)不變，其理化性質(zhì)應(yīng)與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測作用。

2.臨界值質(zhì)控血清

質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點(diǎn)上，定性測定時(shí)處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨界值的制定，應(yīng)按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽性的標(biāo)準(zhǔn)。 臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品和陰性對照品以外的第三個對照品，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性反應(yīng)的標(biāo)本不漏檢。

3.質(zhì)控血清的制備

每個實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的條件，選用臨床中心提供的質(zhì)控血清，或按以下方法自己制備本室使用的質(zhì)控血清(以乙肝質(zhì)控血清為例)。

(1)收集新鮮的無溶血、無黃疸、無細(xì)菌污染的陽性血清。

(2)56℃加熱10小時(shí)來活。

(3)離心或過濾除去沉淀。

(4)用10%的小牛血清或正常人血清(PBS緩沖液)將收集的血清稀釋至所需的濃度。如能用正常的人血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測標(biāo)本。

(5)抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安瓿，封口，20℃保存?zhèn)溆谩２豢煞磸?fù)凍融。被檢物要求檢出的水平常被認(rèn)為是質(zhì)控血清應(yīng)選擇的水平。如果該試驗(yàn)還有其它要求，則應(yīng)加所要求濃度的質(zhì)控物。

(6)標(biāo)定含量。20-30次測定結(jié)果刪除>±2SD數(shù)據(jù)的均值作為靶值，并與已知定值血清對比測定。

二、室內(nèi)質(zhì)量控制程序

臨床檢驗(yàn)的檢測結(jié)果，每次或每天之間不可能*。決定允許的誤差范圍，以臨床上不造成誤診與漏診為準(zhǔn)，通過以下步驟來確定質(zhì)控范圍。

1.*條件下的測定誤差

*條件下已知值質(zhì)控血清變異(optimal conditions variance,簡稱OCV)的測定：在本實(shí)驗(yàn)室*條件下(包括操作者、試劑、儀器等)檢測質(zhì)控血清20-30次，測得結(jié)果計(jì)算，求出該組數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示該實(shí)驗(yàn)室的*工作質(zhì)量。
 

現(xiàn)舉例說明HBsAg ELISA法檢測時(shí)OCV的測定。使用的質(zhì)控制血清為臨界血清，HBsAg濃度為5ng/ml。在該實(shí)驗(yàn)室中選擇素質(zhì)、操作zui熟練的技術(shù)員進(jìn)行認(rèn)真地專門測定，選用*的試劑盒，檢測之前，將恒箱、加樣器等認(rèn)真校正、調(diào)校正、調(diào)試，使用新的加樣吸頭等，即在*、的條件下進(jìn)行檢測。除質(zhì)控血清外同時(shí)測定陰性對照品和陽性對照品。并作雙份測定，得出2個吸光值(A值)，求出X。連續(xù)作20次，求出20個X，即X1……X20。從這20個數(shù)據(jù)中，求出OCV的X和SD。

2.已知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差

常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清變異(routine conditions variance-known value,簡稱RCVK)的測定：做常規(guī)檢驗(yàn)的技術(shù)人員，在常規(guī)檢驗(yàn)的條件下，將質(zhì)控血清放在常規(guī)檢測樣本中，進(jìn)行20次檢驗(yàn)，結(jié)果計(jì)算同OCV法。一般認(rèn)為RCV的SD在OCV的SD兩倍范圍內(nèi)可以接受。若太大應(yīng)該查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室條件后(例如較正加樣器，糾正洗板操作，調(diào)正溫育溫度等)，重新進(jìn)行RCVK的測定。如果RCVK的SD值更小，說明OCV不是*條件下測定的，應(yīng)重新再測OCV。常規(guī)條件下，RCVK肯定要比OCV大。通過質(zhì)控控制各項(xiàng)條件，使RCVK的數(shù)據(jù)盡可能接近OCV值。RCVK的數(shù)據(jù)反映該實(shí)驗(yàn)室日常工作的質(zhì)量，用于作質(zhì)控圖，對室內(nèi)檢驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行控制，每日檢驗(yàn)的結(jié)果，報(bào)告能否發(fā)出。

3.未知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差

常規(guī)條件下,未知值質(zhì)控血清變異(routine conditions variancl-unknown value 簡稱RCVU)的測定：有時(shí)為了避免主觀性,再作RCVU測定。測定步驟同RCVK，但檢測的操作者不知質(zhì)控血清的定值，或在操作者不知哪份是質(zhì)控血汪清的條件下進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)，以排除操作者的主觀性。在此不再舉例說明。

4.臨床應(yīng)用的要求

對任何一個試驗(yàn)都應(yīng)確定一個允許的誤差范圍，前題是滿足臨床要求。如允許誤差定得過小，在臨床上不存在任何意義，但為了符合該規(guī)定卻要花費(fèi)很大人力、物力和時(shí)間。相反，如果將允許誤差定得過大，將使監(jiān)測系統(tǒng)察覺不到臨床上要求檢出的誤差，失去質(zhì)控的意義。

三、室間質(zhì)量評價(jià)(external quality assessment,簡稱EQA)

室間質(zhì)量評價(jià)簡稱室間質(zhì)評，是由質(zhì)控中心采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評價(jià)各實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準(zhǔn)確性，了解各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的差異，并幫助校正，使具有可比性。各實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果報(bào)到質(zhì)控中心，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，得出相互比較的結(jié)果。這種評價(jià)不能控制各實(shí)驗(yàn)室每天發(fā)出的檢驗(yàn)報(bào)告，而是一種回顧性評價(jià)。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測試驗(yàn)結(jié)果的精密度，而室間質(zhì)評主要控制試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，不能互相替代。參與質(zhì)評的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)先做好室內(nèi)質(zhì)控。

1.室間質(zhì)評的方法

(1)發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查

這是國內(nèi)外室間質(zhì)評的常用形式。部臨檢中心對乙肝標(biāo)志物ELISA檢驗(yàn)的室間質(zhì)評采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實(shí)驗(yàn)室，各實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定的日期進(jìn)行檢驗(yàn)，并將檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)至部臨檢中心。部臨檢中心經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，將評價(jià)結(jié)果寄回各實(shí)驗(yàn)室。通過評價(jià)，各實(shí)驗(yàn)室了解本室工作質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)差距，并設(shè)法改進(jìn)，以不斷提高檢驗(yàn)質(zhì)量。 這種評價(jià)方式有一定缺點(diǎn)，即各實(shí)驗(yàn)室常對質(zhì)控物特殊對待，在檢驗(yàn)時(shí)選用特殊試劑盒，選派特別的技術(shù)員進(jìn)行檢驗(yàn)，有的實(shí)驗(yàn)室互相和對結(jié)果并作修改。這就使EQA的結(jié)果不能反映該實(shí)驗(yàn)室日常工作水平。

(2)派觀察員到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試劑調(diào)查

這種調(diào)查事先不通知，臨時(shí)派觀察員到實(shí)驗(yàn)室，采用常規(guī)方法，檢驗(yàn)規(guī)定的一組標(biāo)本，進(jìn)行評價(jià)。這種調(diào)查方式，容易發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)際問題，可以直接給予指導(dǎo)和幫助，解決問題，提高檢驗(yàn)質(zhì)量。這種調(diào)查通常可以使用真實(shí)樣本，避免采用質(zhì)控物的一些缺點(diǎn)。

2.評價(jià)方法

(1)發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查，這是目前國內(nèi)外常見的形式，采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實(shí)驗(yàn)室，各實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定的日期進(jìn)行檢驗(yàn)，并將結(jié)果報(bào)至組織者(部、省臨檢中心)。組織者通過統(tǒng)計(jì)分析，再將評價(jià)結(jié)果寄回實(shí)驗(yàn)室，使其了解工作質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)問題，提高質(zhì)量。其缺點(diǎn)為由于各實(shí)驗(yàn)室吃小灶或互相打修改結(jié)果而達(dá)不到真正評價(jià)作用。

(2)現(xiàn)場調(diào)查，事先不通知，臨時(shí)派出人員到各實(shí)驗(yàn)室，規(guī)定采用常規(guī)方法，檢測一組標(biāo)本，進(jìn)行評價(jià)。這種方法可以解決實(shí)際問題，進(jìn)行現(xiàn)場指導(dǎo)，組織者常因人力、物力的原因而不能經(jīng)常性進(jìn)行。

3.成績計(jì)算方法

(1)定性試驗(yàn)：檢驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，得 100 分，錯誤不得分，總計(jì)實(shí)驗(yàn)室的得分。從全部參評單位的得分中求出該批質(zhì)控物平均分(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，再通過公式計(jì)算出每一個實(shí)驗(yàn)室的得分比值(SI)

SI=(實(shí)驗(yàn)室得分-平均分)/平均標(biāo)準(zhǔn)差(s)

SI 在0.0-0.9 間為良好,1.0-1.9 間為,SI 為負(fù)值時(shí)數(shù)值越大成績越差。

(2)定量試驗(yàn)：SI= (實(shí)驗(yàn)室測定值-預(yù)期值X)/預(yù)期值的標(biāo)準(zhǔn)差s ; SI 越小，表明越靠近靶值，成績越好。

0-1.0 為,1.1-2.0 為良好,>2.0 為差。SI 無正負(fù)之分

四、質(zhì)量改進(jìn)(Quality Improvement，QI)

質(zhì)量改進(jìn)的建議來源于三方面：

(1)室內(nèi)質(zhì)控：提示實(shí)驗(yàn)的精密度差，應(yīng)規(guī)范各項(xiàng)操作；

(2)室間質(zhì)評：提示實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性差，應(yīng)改進(jìn)設(shè)備的準(zhǔn)備或更換試劑；

(3)病人或醫(yī)生的報(bào)怨：提示實(shí)驗(yàn)的偶然誤差，應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控過程是否達(dá)標(biāo)。

五、記錄

1.所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊；原始登記表應(yīng)記錄試劑來源、批號；質(zhì)控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上實(shí)驗(yàn)者姓名及審核者姓名。

2.如試驗(yàn)結(jié)果對臨床診斷有決定意義，其樣本應(yīng)保留，至少與病歷保存期一致。
ELISA質(zhì)量控制