摘要 在梅毒螺旋體人工培養(yǎng)尚未獲得成功的情況下，基因克隆（即DNA重組）技術(shù)的出現(xiàn)為該病原的研究開辟了一條新的途徑。應(yīng)用基因工程技術(shù)目前已制備出多種重組梅毒螺旋體抗原，這些抗原的制備對梅毒發(fā)病機(jī)理的探討、疫苗的研制、以及血清學(xué)診斷試驗(yàn)的建立與應(yīng)用具有重要意義，為梅毒的預(yù)防和控制提供了更加有效的手段。

　　一、概況

　　梅毒是一種臨床表現(xiàn)極為復(fù)雜，幾乎可累及全身各器官的性病。盡管本世紀(jì)40代年發(fā)現(xiàn)了治療梅毒的理想藥物——青霉素，但目前該病在仍然是一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生問題[1]。目前尚未解決梅毒的病原體——梅毒螺旋體（Treponema pallidum,TP）的人工培養(yǎng)問題，從而阻礙了對TP致病機(jī)理探討、疫苗研制、以及梅毒血清學(xué)診斷技術(shù)開發(fā)等方面的深入研究。80年代初，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是基因工程（DNA重組）技術(shù)的出現(xiàn)使梅毒螺旋體的研究進(jìn)入一個新的階段[2]，目前，TP的全部基因組DNA序列已經(jīng)被解析[1]。通過重組TP dNA的克隆以及在大腸桿菌中的表達(dá)，制備出多種重組TP抗原，為梅毒的研究提供了一條新的途徑。現(xiàn)就近10年來有關(guān)重組TP抗原的研究現(xiàn)況進(jìn)行復(fù)習(xí)。

　　二、重組TP抗原的特性及制備

　　目前已重組的TP抗原有近20多種，如TpN15、TpN17、TpN19、TpN29～35（TpD）、TpN44.5（TmP a）、TpN47、TpN35（Tmp c）等[3]。現(xiàn)將其中部分有應(yīng)用前景的重組TP抗原分述如下。

　　（一）TP15kD抗原[4]：15kD蛋白是一種脂蛋白，首先由Hensel等1985年分離鑒定，它在TP膜蛋白中的含量相對較少，但在免疫印跡試驗(yàn)中與人梅毒血清間顯示了*的反應(yīng)性，同時對實(shí)驗(yàn)梅毒兔的淋巴細(xì)胞有很強(qiáng)的增生反應(yīng)，表明15kD蛋白不僅具有較強(qiáng)的體液免疫原性，而且有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫原性，但Centurion-Lara等[5]實(shí)驗(yàn)表明，此蛋白對TP感染沒有任何免疫保護(hù)性。重組15kD抗原基因由Norgard等用特異的單克隆抗體從TP基因庫中篩選得到[4]。其報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒為pMALc2[5]，該質(zhì)粒在DNA插入位點(diǎn)的上游含有麥芽糖結(jié)合蛋白基因，使表達(dá)的融合蛋白易于分離和提純。

　　（二）4D抗原：4D抗原是分子量分19kD的一種TP外膜蛋白，Radolf等[6]研究發(fā)現(xiàn)無論是自然狀態(tài)還是重組4D蛋白都由二巰鍵交叉相聯(lián)成寡聚結(jié)構(gòu)，且耐蛋白酶，表明4D抗原可能在TP外膜保持完整結(jié)構(gòu)中起著非常重要的作用。重組TP4D抗原首先由Feniger等在E coli RRI大腸桿菌中表達(dá)和分離提純[7]。Borenstein等用肌注和靜脈注射的方法探討了重組TP 4D抗原對實(shí)驗(yàn)性梅青的影響，顯示以4D抗原免疫動物后能夠改變實(shí)驗(yàn)梅毒的病程，表明4D抗原免疫實(shí)驗(yàn)動物后，可對感染梅毒產(chǎn)生部分保護(hù)的作用。提示重組TP抗原是制備疫苗的又一可能途徑。

　　（三）TP24 kD抗原：此重組蛋白是以質(zhì)粒pUC8為載體在大腸桿菌中表達(dá)的一種分泌蛋白[8]，具有很強(qiáng)的免疫原性，其編碼TP24kD抗原的DNA序列僅存在于致病性的TP基因中，而非致病性TP中不存在此DNA序列，提示TP24kD抗原與TP的致病性相關(guān)，但與TP致病性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。Hsu等人的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重現(xiàn)24kD的表達(dá)可以改變大腸桿菌的生長形態(tài)，出現(xiàn)與一般大腸桿菌不一樣的扁平粗糙的菌落和絲狀樣生長，表明24KD抗原與TP的生長特性相關(guān)。

　　（四）TmP A和TmP B：TmP a是一個分子量為42kD的TP膜蛋白。Schouls[9]等構(gòu)建了能在大腸桿菌K-12中大量表達(dá)該重組蛋白的質(zhì)粒載體pPLc245。Ijsselmuiden等[10]用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法探討了重組TmPA抗原在血清學(xué)診斷中的意義，通過對148例未治療和167例已治療的梅毒血清以及190例非梅毒血清進(jìn)行了檢測，其敏感性分別為：一期梅毒76%、二期梅毒100%、早期穩(wěn)性梅毒98%，在治療后1年以內(nèi)的梅毒患者中，其抗TmP a的滴度明顯下降，這表明TmP a不僅在梅毒血清診斷中有意義，而且可望用于梅毒治療效果的監(jiān)測。TmP b基因位于TmP A基因下游[9]。Schouls等人的實(shí)驗(yàn)表明，抗TmP b抗體渡度隨著梅毒患者的治療呈下降趨勢，因而可望用于梅毒治療的監(jiān)測。但單獨(dú)用Tmp b抗原不適宜作血清學(xué)診斷，因?yàn)槊范净颊哐宓暮艽笠徊糠謱mp B不起反應(yīng)。Wicher等[11]用重組TP抗原對豚鼠進(jìn)行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組TP抗原中只有TmP B可以改變梅毒的病程，提示重組TmP b抗原在疫苗制備中可能有一定的意義。

　　（五）TP47kD抗原：該蛋白為TP整合性膜蛋白抗原，1986年Norgard等[12]在大腸桿菌中首先克隆及表達(dá)了重組47kD抗原。多中心研究發(fā)現(xiàn)[13]，此蛋白有很強(qiáng)的免疫原性，在TP中含量非常豐富，且為致病菌*的蛋白。Chamberlain等[12]采用含有依賴T7 RNA多聚酶的表達(dá)載體，建立了表達(dá)重組47kD的系統(tǒng)，并對此重組抗原與自TP中分離得到的自然47kD蛋白進(jìn)行了生物學(xué)分析與比較，結(jié)果表明這兩種來源的47kD抗原其生物學(xué)特性相同，均為含蛋白脂質(zhì)，其疏水性可能與致病性有關(guān)。為了探討疏水性結(jié)構(gòu)與抗原性的關(guān)系，Weigel等[14]表達(dá)了非酰化的親水性重組47kD抗原，通過免疫印跡試驗(yàn)對116例不同期的梅毒血清進(jìn)行檢測，表明親水性重組47kD抗原的抗原性保持不變，說明酰化結(jié)構(gòu)與抗原性無關(guān)。

　　除了上述蛋白抗原外尚有多種具有較強(qiáng)抗原性的TP重組抗原，如Tromp2（28kD）[15]，TmPC（35kD）及34kD抗原等。這些重組抗原的生物學(xué)及免疫學(xué)特性等有待進(jìn)一步探討。

　　三、重組TP抗原在血清學(xué)診斷中的應(yīng)用

　　盡管Fujimura等[16]用ELISA檢測了不同重組抗原的免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)G17的反應(yīng)性比M47、S42和G15都高。但近年來的應(yīng)用研究趨向于將2種或2種以上的重組抗原聯(lián)合使用，綜合兩種或多種抗原的不同特性，從而使其具有更高的特異性和敏感性。

　　（一）15kD與47 kD組合[17]：目前認(rèn)為15 kD和47 kD是兩種抗原性zui強(qiáng)的TP蛋白，Zrein等對以重組15 kD和47 kD為抗原的酶免疫試劑盒——ELISyph-rG的敏感性和特異性進(jìn)行了評價。在TPHA檢測陽性的血清中，其ELISyph-rG結(jié)果和TPHA抗體滴度之間的相關(guān)性為0.94。在對VDRL方法檢測為陰性的1822份正常健康自愿者血清（其中440份血清用TPHA檢測為陰性）檢測后，結(jié)果在這1822份血清中用ELISyph-rG法檢測出4份陽性血清。用FTA-ABS和WB法對陽性血清進(jìn)行進(jìn)一步確證發(fā)現(xiàn)，其敏感性達(dá)100%，特異性大于99.8%，認(rèn)為以重組15 kD和47 kD為抗原的ELISyph-rG法可代替VDRL和TPHA法，適合用于大樣本的篩檢。

　　（二）15 kD、17 kD、47 kD組：此3種TP抗原存于梅毒的整個病程中[18]，包括晚期穩(wěn)性梅毒。尤其對于伴有HIV感染的梅毒患者在抗TP的含量低于一般梅毒患者的情況下亦能檢測到抗47 kD抗體。Gerber等[3]人對3種重組抗原的聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明18例梅毒患者中，17例患者在整個病程中均可檢測到抗體，而42例正常人血清中無1例抗體陽性，提示這種檢測方法有很高的敏感性和特異性。Young等[18]對這3種重組蛋白為抗原的酶免疫試劑盒——ICE syphilis（immune-capture EIA）進(jìn)行了評價，并與自然TP為抗原的試劑盒——Captia SelectSyph-G、TPHA、FTA-ABS及VDRL進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示ICE Syphilis的特異性明顯高于Captia selectSyph-G（分別為99.8%與99.2%，P<0.02>，其敏感性也明顯高于Captia selectSyph-G、FTA-ABS及TPHA（分別為99%～100%，P<0.01，91.4%～92.4%，92.4%和97.1%>。在15例伴HIV感染的梅毒患者中，血清ICE syphilis檢測結(jié)果均為陽性，而Captia selectSyph-G檢測結(jié)果出現(xiàn)3例陰性。由此可見，ICE syphilis 檢測方法的高特異性及高敏感性將為梅毒的篩檢測提供一種理想的手段。

　　young等還建立了應(yīng)用這3種重組蛋白為抗原的快速檢測梅毒的膠乳凝集方法——Syphilis fast [19]，并通過檢測1518份隨機(jī)血清標(biāo)本，對Captia selectSyph-G和VDRL的特異性進(jìn)行了比較，以及在99份各期梅毒血清和15例篩檢陽性的血清中對其敏感性進(jìn)行了評價，其特異性（99.8%）明顯高于Captia SelectSyyph-G（99.2%）和VDRL（99.1%）（P<0.02>，但其敏感性與Captia selectSyph-G間沒顯著性差異（分別為93%和92.1%），但這兩種方法的敏感性均顯著高于VDRL（46.5%）（P<0.001）。由此可見，Syphilis fast法可望成為一種特異性高、檢測速度快、操作簡便的梅毒篩檢方法。

　　四、展望

　　farley 等[20]認(rèn)為，對有關(guān)人群進(jìn)行梅毒篩檢是控制和預(yù)防梅毒的重要措施之一。目前常規(guī)用于梅毒篩檢和診斷的血清學(xué)試驗(yàn)主要有兩種，一種是對脂類抗原的非螺旋體試驗(yàn)方法（如VDRL、RPR），另一種是特異性梅毒螺旋體試驗(yàn)（如TPHA、FTA-ABS）。前者敏感性和特異性不高，存在著假陽性和假陰性，而后者zui大的問題是抗原來源的缺乏，尚未得到解決。因?yàn)門P目前還不能人工培養(yǎng)，其用于診斷試驗(yàn)的TP主要通過兔睪丸接種獲得，這既需要一定的實(shí)驗(yàn)室條件，又費(fèi)時、費(fèi)力、費(fèi)材料。因此探討重組TP抗原的梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用是制備重組抗原的主要目的之一，重組蛋白的制備使我們能夠在實(shí)驗(yàn)室里得到不同目的抗原，這一方面為建立現(xiàn)有梅毒血清學(xué)診斷的替代方法提供了條件，同時又為建立特異性和敏感性更高的診斷新方法奠定了基礎(chǔ)，如通過重組抗原制備單克隆抗體，以建立檢測梅毒抗原的方法，將為神經(jīng)梅毒、早期隱性梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷提供新的手段。同時通過對不同重組抗原的結(jié)構(gòu)，以及生物學(xué)和免疫學(xué)的分析，可以達(dá)到篩選TP致病因子和開發(fā)TP疫苗的目的，為TP的預(yù)防和治療提供更加有效的手段。